免疫组化实验步骤有哪些？-ZOL问答

4个回答默认排序

默认排序

按时间排序

没找到满意答案？去问秘塔AI搜索

取消复制问题

组织免疫组化染色标准操作流程如下：
首先进行组织包埋，将待检样本经固定、脱水、透明等处理后，浸入石蜡中完成包埋，确保组织结构完整、切片均匀。随后使用切片机将包埋好的蜡块切成厚度为3–5微米的连续切片，并贴附于防脱载玻片上，经60℃烘烤1小时以增强组织与玻片的黏附性。
切片完成后进入脱蜡环节：依次将载玻片浸入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5分钟，再经100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇梯度水化各3分钟，最后用蒸馏水充分冲洗，彻底去除石蜡及有机溶剂。
抗原修复是关键步骤：脱蜡水化后的切片先以3%过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性；蒸馏水充分洗涤两次后，滴加pH 6.0柠檬酸盐缓冲液覆盖组织，置于微波炉中中火加热至液体微沸（约3分钟），自然冷却至室温；重复加热—冷却过程一次，使被掩蔽的抗原表位充分暴露。
血清封闭：弃去缓冲液，蒸馏水轻洗两次，再置入PBS缓冲液中平衡5分钟，重复两次；用滤纸小心吸干组织周围液体，立即滴加10%正常血清封闭液（即100?μL血清+900?μL PBS），37℃湿盒中孵育30分钟，以减少非特异性结合。
一抗孵育：倾去封闭液，滤纸吸干，按预定浓度加入特异性一抗，对照组以等体积PBS替代；4℃冰箱过夜孵育，确保抗体与靶抗原充分结合。
次日进行二抗反应：取出切片，PBS震荡洗涤3次，每次5分钟；吸干液体后滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30分钟。
随后加入链霉亲和素-生物素复合物（SABC）：PBS洗3次后，滴加1:100稀释的SABC工作液（10?μL SABC + 990?μL PBS），37℃孵育30分钟。
显色反应：PBS清洗完毕后，吸干水分，现配现用DAB显色液——于1?mL蒸馏水中依次加入1滴DAB试剂A、1滴过氧化氢试剂B、1滴磷酸盐缓冲试剂C，充分混匀后立即滴加至组织区域，室温避光显色3–8分钟，密切观察着色程度，及时终止反应。
苏木精复染：蒸馏水快速漂洗终止显色后，将切片浸入苏木精染液中，动物组织染色约30秒，植物组织需3–5分钟，以实现细胞核清晰对比。
脱水透明：复染后流水冲洗，依次经70%、80%、90%、95%乙醇各2分钟，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2分钟，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各2分钟，最后置于新鲜二甲苯中，移入通风橱备用。
封片：在组织一侧滴加适量中性树胶，以盖玻片一侧先接触胶液，缓慢倾斜覆盖，避免气泡产生；平置通风橱内自然干燥24小时以上，待胶体完全固化后即可镜检与保存。

取消评论